在過去的五年中，熒光蛋白在監測體內生物學研究中，起到越來越重要的作用。源于維多利亞多管發光水母中的綠色熒光蛋白(GFP)是zui早被我們應 用的熒光蛋白，但是隨著時間的推移，現在我們可以使用的熒光蛋白種類也越加豐富，包括加強型的變異GFP蛋白、從其他種類水母中發現的熒光蛋白和珊瑚礁蛋 白。它們都可以在眾多的細胞和組織中被克隆復制，從細菌到酵母，從植物到哺乳動物。這些熒光蛋白穩定、細胞毒性小、而且不需要額外的輔助也能在體內產生可 見的熒光。因此，它們可以被用作分子靶標或者獨立的報告因子去視化、追蹤和定量多種不同的細胞進程，包括細胞合成與代謝，蛋白轉運，基因誘導和細胞譜系。 不同的熒光蛋白具有不同的顏色，因此也可被用于多重檢測。這些熒光蛋白都能被熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測到。但是相應的，如果我們不做細胞分選或監測細胞 內遷移，微孔板熒光讀板儀將是一個更好、更方便和更高通量的檢測系統。下面，我們將會向大家展示Molecular Devices酶標儀如何利用”無創”技術檢測活細胞熒光蛋白。

我們將從BD Biosciences Clontech公司獲得的三株HEK-293細胞系進行不同熒光蛋白的穩定轉染。這次研究的目的：1）優化三株細胞系的波長設置，2）通過稀釋細胞系來確定檢測下限LLD，3）證明在一種細胞系中識別另一種細胞系的可行性。

材料：

HEK-293細胞系穩定表達三種熒光蛋白：

AcGFP---多管發光水母中產生的另一種GFP(但不同于維多利亞水母)

ZsGreen---與GFP相似，但更亮(來自珊瑚礁)

DsRed---一種來自珊瑚礁的紅色熒光蛋白非轉染的HEK-293細胞系，作為對照

 

細胞都培養在大燒瓶中，應用含10% FBS+ 1% Pen/Strep/L-glutamine +500 μg/mL G 418的DMEM的培養基。沒有轉染的HEK-297細胞作為對照。在實驗前一夜，對細胞進行胰酶消化，然后進行密度梯度稀釋，zui終密度范圍為從 500,000到100個細胞每毫升。然后把它們過夜接種到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此，接種的細胞密度就是50,000到 10個細胞每孔(96孔板)和12,500到2.5個細胞每孔(384孔板)。每個稀釋都做12個重復。第二天分別用SpectraMax M5和Gemini EM兩臺儀器對酶標板進行底讀和頂讀檢測。

 

SpectraMax M5和Gemini EM都是基于單色器的掃描式熒光讀板儀。針對每一個特殊熒光染料，其激發波長和發射波長都可以在背景之上進行信號優化，這點也是濾光片式酶標儀所不具備 的。總的來說，優化策略就是：用低于理論zui大激發波長20-25nm的激發光激發，然后初掃發射波長；其次用高于理論zui大發射波長20-25nm的發射光 掃激發波長。掃描后將給出實際的激發與發射波長。zui后可以結合信號/背景分析再做其他額外的掃描來確定zui終的結果。（根據斯托克頓位移理論，激發波長應該 更低、發射波長應該更高，并且需要一個發射光阻隔濾片來隔離掉非目的波長的光信號）。而且可能還會因為要選擇*阻隔濾片而再進行兩次掃描。

 

用Gemini EM對DsRed進行波長掃描，以此舉例如何進行波長優化。為了檢測zui大激發波長， 我們首先固定發射波長為600nm，然后對發射波長進行掃描。掃描結果顯示zui大激發波長為556nm。(圖1)同樣為了檢測zui大發射波長，我們固定激發波 長為535nm，然后掃描發射波長，從而得到584nm的結果。(圖2)激發與發射值都與被發表的波長結果557/579相近。

 

 

 

下一步就是要結合信號/背景優化結果確定*激發和發射波長。因為初步檢測結果的斯托克頓位移偏小(22nm)，顯然是要通過降低激發波長和增 大發射波長來擴大兩者之間的差異，其次還需要找到合適的發射光阻隔濾片優化*靈敏度。zui終，我們使用5 5 0nm的激發波長來激發， 同時使用570nm的發射光阻隔濾片隔離掉不想要的高于570nm以上的激發光。通過575到600nm的發射波長掃描DsRed轉染的細胞，結果顯示在 587-588nm處會有峰值出現(圖3，上面的曲線)。背景(沒有轉染的細胞)區域中，點就相對比較平緩(圖3，下面的曲線)。基于本次掃描，我們zui終 優化的設置為550nm激發、588nm發射、575nm作為發射光阻隔濾片。

觀察到的zui大值與我們建議用于定性分析的設置都總結在列表1中。

 

 

 

采用底讀得到的細胞稀釋結果詳見圖4(96孔板)和圖5(384孔板)。頂讀結果詳見圖6(96孔板)和圖7(384孔板)。ZsGreen細 胞系(上面的曲線)的亮度是其它兩種細胞系的將近3.5倍。盡管DsRed細胞系的結果暗于ZsGreen，但兩種細胞系的檢測靈敏度卻相近。(列表2的 下圖)，因為背景值低于DsRed的波長。

 

 

 

 

 

總的來說，圖中的點稍微有些非線性，zui上方會有一點下降。我們推斷是因為細胞在高濃度時，會有貼壁生長的趨勢，所以會造成非線性的結果。列表2 給出了所有細胞系確認得到的檢測下限L L D 。其中L L D 的計算方法是：3SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(沒有細胞的培養基)的標準差，Slope是曲線底部的斜率。(對于96孔板和 384孔板，分別使用了10,000個細胞每孔和2500個細胞每孔的數據)。非轉染細胞的RFU信號和標準差結果都與只含有培養基的結果相似。

在本次實驗中，ZsGreen和DsRed細胞系在底讀模式都有著相似的檢測限，而且兩者都比AcGFP細胞系的檢測下限低3到4倍。本次實驗 一共重復了三次，但是DsRed實驗結果并不是每次都能表現的足夠好。在一次實驗中，它的檢測下限近似于AcGFP，但是在另一次實驗中，它的檢測下限又 會很高。我們將這些區別歸結于不同細胞系的通道數目不同。(伴隨著一個成功的通道，細胞就會變得越暗)DsRed細胞系在實驗開始階段比其它細胞系長得 快，所以在*次實驗中，它比其它細胞系多2-4倍的通道，結果就顯然不夠理想。

 

 

 

對于AcGFP和ZsGreen細胞系，當采用頂讀時，檢測下限升高將近三倍。另一方面，對于DsRed，當采用頂讀時，檢測下限會升高將近 10-20倍。我們認為造成這種靈敏度下降的原因在于DMEM培養基有紅色熒光信號，會對結果有內部干擾。事實也證明，將培養基換成無色的HBSS，相應 的DsRed的頂讀結果也會變好。列表3展示了將有色培養基換成無色培養基的結果。底讀并沒有太多改變(盡管AcGFP的檢測下限看起來改善了)，證明這 種操作方法并沒有導致細胞的損失。然而頂讀結果卻讓靈敏度改善了將近三倍。這些結果也從某一方面支持了一種理論，那就是有色培養基會一定程度上影響頂讀的 靈敏度。

 

 

 

在本次實驗中，我們在一個96孔板里混合了多種細胞，保證每個孔大約50,000個細胞。因此，如果是1:1混合，那么每種細胞會有 25,000個。如果是1:1:1混合，那么每種細胞將有1 6 , 7 0 0 個。實驗板分別用480/510nm(AsGFP和ZsGreen的優化結果)和550/588nm(DsRed設置)的激發和發射來檢測。觀察到的 RFU值與預測值接近。結果總結如下。結果顯示，AsGF P和ZsGreen可以和DsRed一起檢測，反之亦然。(見圖表4)

 

 

 

Molecular Devices公司的熒光讀板儀可以檢測完整貼壁細胞中的熒光蛋白。波長掃描可調的功能可以優化每一種*熒光染料的波長結果。底讀模式提供*檢測靈敏 度，頂讀模式也可以提供可利用的數據，尤其是對含有ZsGreen和DsRed的細胞系。頂讀模式檢測DsRed細胞系時，可以通過替換無色培養基來達到 優化實驗結果的目的。