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6酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)ELISA 試劑盒

競爭法

競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達充分的量。洗滌。

⑶加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原多，故顏色深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來終確定體系的終檢測目標的濃度。

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。

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定量測定

ELISA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的*，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數值，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是理想的檢測區域。

測定小分子量物質常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線注意圖中橫坐標為對數關系，這更有利于測定系統的表達。

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操作程序

1.   分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入標準品50μl；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

5.   測定：以空白孔調零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

6.   根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應該乘以總稀釋倍數。